Effects of chitosan oligosaccharides on human blood components

• 1 отделение нейрохирургии, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай
• 2 Исследовательская лаборатория нейрохирургии, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай
• 3 Институт переливания крови Китайской академии медицинских наук и Медицинского колледжа Пекинского союза, Чэнду, Китай
• 4 Западно-Китайский центр исследования мозга, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай
• 5 Отделение интегрированной традиционной и западной медицины, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай

Олигосахарид хитозана (COS) обладает противоопухолевой, противовоспалительной, антиоксидантной и антибактериальной активностью, а также участвует в биологическом распознавании и может усиливать иммунный ответ. Эти свойства привлекают внимание исследователей, работающих над лекарственными средствами и продуктами питания, косметикой, биоматериалами и тканевой инженерией. По сравнению с соответствующим полимером COS лучше всасывается в кишечнике, благодаря чему быстрее попадает в кровоток и может взаимодействовать с компонентами крови. Однако влияние COS на компоненты крови пока изучено недостаточно. В этой работе два образца COS с разной молекулярной массой охарактеризовали методами FTIR и ¹H ЯМР, затем оценили их воздействие на компоненты крови человека: эритроциты (гемолиз, деформируемость и агрегация), систему свертывания крови (активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и концентрацию фибриногена), систему комплемента (активацию C3a и C5a) и тромбоциты (активацию и агрегацию). Влияние COS на эритроциты зависело от дозы и молекулярной массы: риск гемолиза оставался низким, однако при высоких концентрациях наблюдалась необратимая агрегация. COS проявлял слабую антикоагулянтную активность, связанную с блокированием внутреннего пути свертывания крови. При этом COS не влиял на активацию комплемента (C3a и C5a) и тромбоцитов, но заметно ингибировал агрегацию тромбоцитов. На основании результатов авторы предложили механизм воздействия COS на компоненты крови.

Введение

Олигосахарид хитозана (COS) представляет собой олигомер хитозана со средней молекулярной массой (ММ) < 5000 Да, его химическая структура, как и у хитозана, представляет собой линейный бинарный сополимер, состоящий из β-1,4-связанного 2-ацетамидо-2- дезокси-β-D-глюкопираноза (GlcNAc) и 2-амино-2-дезокси-β-D-глюкопираноза (GlcN) (Kumar et al., 2004; Muanprasat and Chatsudthipong, 2017). Большой исследовательский интерес к этому олигомеру обусловлен не только его физико-химическими свойствами, такими как лучшая растворимость в воде и катионная природа при нейтральном pH, но также и его биологической активностью, например, противоопухолевой, противовоспалительной, антиоксидантной, противовоспалительной. -бактериальная активность, биологическое распознавание и эффекты усиления иммунитета (Liu et al., 2009; Lu et al., 2014, 2015; Zhang et al., 2014, 2018; Huang et al., 2016; Kunanusornchai et al., 2016). Мэттавевонг и др., 2016; Динг и др., 2017; Эти уникальные свойства и деятельность постоянно привлекают внимание многих исследователей в области лекарств, продуктов питания, косметики, биоматериалов и тканевой инженерии (Swiatkiewicz et al., 2015; Lee et al., 2017; Bai et al., 2018; El-Sayed et al., 2018; Нан и др., 2018).

Хотя использование COS расширилось во многих исследовательских и прикладных областях, существуют некоторые дилеммы, которые необходимо прояснить. Например, хорошо известно, что пероральное введение COS имеет гораздо более высокие профили абсорбции на уровне кишечника, чем у его соответствующего полимера хитозана, что приводит к его быстрому доступу в кровоток и потенциальному контакту с компонентами крови (Chae и др., 2005). Это также применимо к тканеинженерным каркасам на основе хитозана, поскольку деградированные фрагменты, состоящие в основном из COS, в конечном итоге попадут в кровообращение. По этим причинам необходимо учитывать влияние COS на кровь, такие как ее основные компоненты, включая эритроциты (эритроциты), коагуляцию, адсорбцию белка, комплемент и тромбоциты, поскольку гемосовместимость COS до настоящего времени не была описана. В целом, хитозан образовывал коагулят при контакте с цельной кровью, где тромбоциты демонстрировали отчетливую адгезию к его поверхности в течение короткого времени, а время свертывания, как сообщалось, сокращалось на 40% по сравнению с цельной кровью (Rao and Sharma, 1997; Chen et al.). др., 2017). В результате хитозан обычно используется в качестве кровоостанавливающей повязки для заживления ран в клинике, а не в качестве медицинского устройства, контактирующего с кровью (Muzzarelli et al., 2005). Гемостатические свойства объясняются поликатионными свойствами хитозана и его неспецифическим связыванием с клеточными мембранами за счет положительно заряженных аминогрупп вдоль молекулярных цепей (Benesch and Tengvall, 2002). Однако в случае COS наблюдались некоторые другие явления. Лин и др. сравнили время свертывания цельной крови COS и хитозана и обнаружили, что первый не оказывает гемостатического эффекта (Lin and Lin, 2003). Аналогично, Фернандес и др. изучили взаимодействие COS с эритроцитами человека, и результаты показали, что значительного гемолиза не наблюдалось, а повреждение COS эритроцитов зависело от концентрации и молекулярной массы использованных образцов (Fernandes et al., 2008). Вышеупомянутые отчеты показали, что COS, по-видимому, обладает лучшей гемосовместимостью, чем хитозан. Помимо положительно заряженных аминогрупп, в молекулярных цепях COS имеются многочисленные гидроксильные группы. Предыдущие исследования влияния функциональных групп, таких как гидроксильные, карбоксильные и аминогруппы, на компоненты крови показали, что гидроксильные группы приводят к лёгкому антикоагулянтному эффекту, а также активация комплемента, несмотря на отсутствие сообщений о COS (Sperling et al., 2005). В связи с этим можно ожидать, что гидроксильные группы молекулярных цепей COS, вероятно, также оказывают определенное специфическое влияние на компоненты крови.

Мы предполагаем, что COS будет влиять на компоненты крови иным образом, чем хитозан, что может быть связано с его молекулярной массой и функциональными группами вдоль молекулярных цепей. Чтобы опровергнуть эту гипотезу, в этой работе было всесторонне исследовано влияние COS с двумя разными молекулярными массами на компоненты крови человека (рис. 1). В частности, влияние COS на эритроциты включало гемолиз, деформируемость и агрегацию; свертывание крови оценивали по времени свертывания, включая протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и тромбиновое время (ТТ), а также концентрацию фибриногена (Фиб); для системы комплемента рассматривали комплемент 3a (C3a) и 5a (C5a) с использованием метода ELISA; а в отношении тромбоцитов определяли активацию и агрегацию тромбоцитов. На основании приведенных выше результатов был обсужден и предложен механизм действия.

Рисунок 1. Схематическое представление COS и компонентов крови.

Материалы и методы

Подготовка материалов

Два образца COS с различной молекулярной массой, 3 (COS-3K) и 5 (COS-5K) кДа, были приобретены у Zhejiang Aoxing Biotechnology Co., Ltd. (Чжэцзян, Китай). Оба образца были получены путем ферментативного гидролиза хитозана, полученного из панцирей крабов. ПЭИ и гепарин натрия были приобретены у Aladdin Co., Ltd. (Чэнду, Китай). Наборы для коагуляции были приобретены у Union Bio-tech Co., Ltd. (Чэнду, Китай). Набор ELISA Kit II был приобретен у Becton-Dickinson Co., Ltd (США). Агенты, связанные с проточной цитометрией, изотиоцианат анти-CD61-флуорецеина (FITC) и анти-CD62p-фикоэритрин (PE) были приобретены у BD Pharmingen, BD Bioscience Co., Ltd. Аденозиндифосфат и адреналин, которые были индукторами агрегации тромбоцитов, были приобретены у Kelong Co., Ltd. (Чэнду, Китай). COS-3K/5K смешивали с физиологическим раствором для получения исходного раствора COS.

Характеристика структуры

Структуру двух образцов COS охарактеризовали методами ИК-Фурье-спектроскопии (FTIR) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Для FTIR применяли таблетки KBr и спектрометр Nicolet 670; спектры ¹H ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker AV II400 МГц.

The degree of deacetylation (DD) was calculated from the ¹H NMR spectrum. In equation (1), $A_{{\mathrm{CH}}_3}$ is the integrated signal of the N-acetyl group protons, and $A_{\mathrm{GlcNH}-2}$ is the integrated signal of the H-2 proton in GlcN units.

Сбор крови

Исследование было одобрено Этическим комитетом Института переливания крови Китайской академии медицинских наук и Медицинского колледжа Пекинского союза. Образцы цельной крови с антикоагулянтом (3,8% цитрат натрия/кровь 1:9) и свежезамороженной плазмы (СЗП), антикоагулированной цитрат-фосфат-аденином, использованные в этом исследовании, были получены из Центра крови Чэнду. Для тестов на эритроциты суспензию эритроцитов получали путем трехкратной промывки антикоагулянтной цельной крови физиологическим раствором и последующего доведения гематокрита (HCT) до 10%. Образцы цельной крови центрифугировали при 1200 g в течение 20 минут при 4°C для получения плазмы, бедной тромбоцитами (PPP), и при 150 g в течение 10 минут при 4°C для получения плазмы, богатой тромбоцитами (PRP).

Красные кровяные клетки

Гемолиз

Промытую суспензию эритроцитов с 10% HCT (270 мкл) смешивали с раствором COS-3K/5K (30 мкл) до получения конечной концентрации COS 0,01, 0,1, 0,5, 1 мг/мл. Затем смеси осторожно центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин после 1 ч инкубации при 37°С. Супернатант (0,02 мл), полученный после центрифугирования, добавляли к раствору ортотолидина (1 мл; 0,2 г в 60 мл уксусной кислоты) и перекиси водорода (1 мл; 1 г/л). После инкубации в течение 10 мин реакцию останавливали смешиванием с уксусной кислотой (10 мл; 10%). Спектрофотометр использовали для измерения оптической плотности при длине волны 435 нм. Стандартный раствор гемоглобина с концентрацией 100 мг/л использовали в качестве стандартного контроля, а разбавленную воду (ДВ) использовали в качестве контроля гемолиза. Чтобы определить процент гемолиза, использовали уравнение (2) (Lewis, 1965). Here, $A_1$ is the sample absorbance at 435 nm; $A_{\mathrm{S}}$ is the absorbance of the 100 mg/L standard hemoglobin solution; $\mathrm{Hct}$ is hematocrit as a percentage; and $C_{\mathrm{Hb}}$ is the hemoglobin concentration in g/L.

Деформируемость

Для измерения деформируемости эритроцитов промытую суспензию эритроцитов (270 мкл) инкубировали с исходным раствором COS (30 мкл) до достижения конечной концентрации 0,01, 0,1, 0,5 и 1 мг/мл. После инкубации в течение 1 ч суспензию центрифугировали при 1500 g в течение 4 мин, а затем осторожно смешивали осадок с 1 мл раствора поливинилпирролидона (15% в PBS). Использовали систему лазерной дифракции эктацитометра (LBY-BX, Beijing Pencil Instrument Co., Ltd, Китай). В систему добавляли около 0,5 мл смеси и подвергали сдвигу между двумя концентрическими цилиндрами машины, в которых размер зазора составлял 0,5 мм, при четырех различных напряжениях сдвига: 0,39, 0,77, 1,54 и 7,7 Па (соответствующих сдвиговому напряжению). скорости 50, 100, 200 и 1000) при 37°С. Затем параметр был представлен системой как индекс удлинения (EI) посредством измерения дифракции проходящего лазера. В качестве стандартного и положительного контроля соответственно использовали физиологический раствор и разбавленную воду, смешанную с суспензией эритроцитов.

Агрегация

Чтобы определить, может ли COS приводить к агрегации эритроцитов, образцы цельной крови с антикоагулянтом (270 мкл) смешивали с исходным раствором COS (30 мкл) до достижения конечной концентрации 1 и 5 мг/мл в течение 1 часа инкубации. Затем смеси центрифугировали при 1000 g в течение 3 минут. Осадок (3 мкл) и надосадочную жидкость (40 мкл) осторожно перемешивали и смеси (4 мкл) превращали в предметные стекла. Изображения слайдов были сняты цифровой камерой микроскопа. В качестве положительного контроля использовался полиэфиримид (ПЭИ), который может приводить к очевидной агрегации эритроцитов, а в качестве стандартного контроля использовался физиологический раствор.

Коагуляция

Активированное частичное тромбиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и концентрацию фибриногена (Фиб) измеряли для определения влияния COS на систему свертывания крови с помощью модифицированной стратегии в соответствии с предыдущим исследованием (

Никитина и др.). ., 2018

). Вкратце, исходный раствор COS (60 мкл) смешивали с FFP (540 мкл) до достижения конечной концентрации 0,01, 0,1 и 0,5 мг/мл, а затем инкубировали при 37°C в течение 3 минут. Для тестирования инкубированного СЗП использовали анализатор коагуляции (Instrumentation Laboratory ACL ELITE, США). Диапазон параметров, доступный для аппарата, составляет от 6 до 245 с для APTT, от 5 до 165 с для PT и от 3 до 169 с для TT. NS использовали в качестве стандартного контроля, а гепарин (HP, конечная концентрация 0,75 МЕ/мл) использовали в качестве положительного контроля. Значения вышеуказанных тестов коагуляции были средними по трем измерениям, а результаты выражались как $\text{среднее}\pm \text{стандартное отклонение (SD)}$.

Активация комплемента

Активация комплемента отражает влияние COS на систему комплемента. Мы сосредоточились на активации человеческого комплемента C3 и C5 в кровообращении и измерили их расщепленные фрагменты C3a и C5a. Метод измерения следовал стандартному протоколу ELISA Kit II (Becton-Dickinson Co., Ltd, США). Вкратце, сыворотку (90 мкл) инкубировали с COS (конечная концентрация 0,1 и 1 мг/мл) при 37°C в течение 1 часа. Затем инкубированную сыворотку (100 мкл) и стандартный раствор (100 мкл) набора соответственно смешивали с разведением ИФА (50 мкл) в покрытых антителами хорошо запечатанных образцах при комнатной температуре в течение 2 часов. После этого лунки промывали и добавляли детектирующие антитела и ферментный концентрат из набора для инкубации в течение 1 часа. Наконец, лунки считывали и измеряли поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра (EON, Bio-Tech CO., Ltd, США). Концентрацию С3а и С5а рассчитывали по стандартной кривой стандартных образцов набора.

Тромбоцит

Активация

В этом тесте были задействованы CD61, специфический маркер поверхности тромбоцитов, и CD62p, маркер активированных тромбоцитов. Богатую тромбоцитами плазму (PRP) (90 мкл) инкубировали с исходным раствором COS (10 мкл) при 37°C в течение 1 часа до получения конечной концентрации 0,1 и 0,5 мг/мл. Инкубированную PRP (5 мкл) смешивали с изотиоцианатом анти-CD61-флуоресцеина (5 мкл), анти-CD62p-фикоэритрином (5 мкл) и буфером PBS (10 мМ, 40 мкл) в темноте в течение 15 минут, а затем добавляли 400 мкл. буфера PBS. Проточную цитометрию (Becton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США) использовали для измерения количества тромбоцитов, экспрессирующих CD62p. В качестве нормального контроля и положительного контроля использовали физиологический раствор и тромбин (10 ед./мл) соответственно (Zong et al., 2013).

Агрегация

Чтобы выяснить, влияет ли COS на агрегацию тромбоцитов, PRP (270 мкл) инкубировали с исходным раствором COS (30 мкл) при 37°C в течение 1 часа. После инкубации мы добавили аденозиндифосфат (0,1 мМ, 12,5 мкл) и адреналин (0,15 мМ, 12,5 мкл) к инкубированной PRP, чтобы вызвать агрегацию тромбоцитов. Для измерения степени агрегации использовали агрегометрию (MODEL700, CHRONO-LOG CO. LTD, США). В качестве контрольных групп использовали PRP, инкубированные с физиологическим раствором и тромбином (10 ЕД/мл).

Статистический анализ

Все результаты были описаны как $\text{средние значения}\pm \text{стандартное отклонение (SD)}$. Статистический анализ всех данных проводился с использованием SPSS 19 (IBM, Statistic Package for Social Science). Статистически значимым считалось значение

.

Результаты и обсуждения

Структурная характеристика COS

Спектры FTIR двух образцов COS показаны на рисунке 2; оба демонстрируют характерные полосы поглощения, аналогичные ранее описанным для хитозанов с высокой степенью DD. Полоса поглощения около $3430$ ${\text{см}}^{-1}$ относится к валентным колебаниям NH и OH (Chen et al., 2016; Wu et al., 2017). Пики при $2880,2930$ ${\text{см}}^{-1}$ относятся к валентным колебаниям CH, а пики при $1650,1630,1320$ ${\text{см}}^{-1}$ — к амидам I, II и III соответственно. Полоса при 1380 соответствует деформационным и валентным колебаниям CH, а полосы в диапазоне 1150–890 — особенностям полисахаридной структуры. Как отмечалось ранее, COS, полученный химическими методами деградации, например окислением перекисью водорода, демонстрировал ослабленную амидную полосу I из-за отрыва атомов водорода от C-1 и C-2 в ходе деградации, что приводило к частичному дезаминированию. Однако оба исследованных образца COS, полученные ферментативным гидролизом, сохраняли сильную амидную полосу I. Это указывает на высокую степень DD в этих образцах.

Figure 2. FTIR spectra of the two COS samples.

Химическую структуру двух образцов COS дополнительно изучали методом ¹H ЯМР. Как показано на рисунке 3, спектры двух образцов были схожи. Согласно литературным данным, сигналы при 2,0 и 3,1 м. д. относятся к протонам ${\mathrm{CH}}_3$ и H-2 GlcN соответственно. В области слабого поля сигналы при 3,5–4,0 м. д. относят к H-3, H-4, H-5 и H-6 GlcN, а также к H-2, H-3, H-4, H-5 и H-6 GlcNAc; сигнал при 4,5 м. д. — к H-1 GlcN (Тромботто и др., 2008). По сравнению с ранее описанным спектром ЯМР хитозана существенных различий между образцами не обнаружено. Значения DD для обоих образцов рассчитали по спектрам ¹H ЯМР согласно уравнению (1). DD составила 88,4% для COS-5K и 87,4% для COS-3K, что согласуется с результатами FTIR.

Figure 3. ¹H NMR spectra of the two COS samples.

The structural units from the original diagram are written as formulas: GlcN — ${\mathrm{C}}_6{\mathrm{H}}_{11}{\mathrm{NO}}_4$; GlcNAc — ${\mathrm{C}}_8{\mathrm{H}}_{13}{\mathrm{NO}}_5$.

Красные кровяные клетки

Чтобы изучить влияние двух COS на эритроциты, были изучены три основных параметра эритроцитов, включая гемолиз, деформируемость и агрегацию. Гемолиз является решающим и прямым параметром, оценивающим безопасность биоматериалов, и определяется как процент лизиса эритроцитов при взаимодействии биоматериала с суспензией эритроцитов ( Fernandes et al., 2008 ). Согласно ISO10993-5, процент гемолиза, вызванного экзогенными материалами, менее 5% считался низким риском ( Weber et al., 2018 ). Как показано на фигуре 4 , процент гемолиза представлен дозозависимым образом. При повышении концентрации от 0,1 до 1 мг/мл гемолиз увеличивался с $0\mathrm{,}30\pm 0\mathrm{,}10$ до $1\mathrm{,}15\pm 0\mathrm{,}14$ % ( р < 0,01) в группе COS-3K и с $0\mathrm{,}30\pm 0\mathrm{,}06$ до $1\mathrm{,}42\pm 0\mathrm{,}30$ % ( р < 0,01) в группе COS-3K. Группа КОС-5К. При концентрации ниже 0,1 мг/мл гемолиз в обеих группах COS не имел достоверных различий с таковым в группе NS. Мы также наблюдали, что гемолиз в группе COS-5K был значительно выше, чем в группе COS-3K, когда концентрация была выше 0,1 мг/мл, что указывает на то, что гемолиз COS также проявляется как MW-зависимый характер.

Рисунок 4. Процент гемолиза суспензии эритроцитов, индуцированный COS.

NS, физиологический раствор; ДВ, разбавленная вода. * р < 0,05; ** р < 0,01.

Что касается деформируемости эритроцитов, индекса, отражающего способность эритроцитов изменять форму своего двояковогнутого диска под действием экзогенной силы со стороны сосудистых стенок, в тестах мы использовали четыре различных силы сдвига ( Чжао и др., 2010 ). Как показано на рисунках 5A–D , при увеличении силы сдвига от 0,39 до 7,7 Па (соответствующей скорости сдвига от 50 до 1000) индекс элонгации обычно увеличивался, за исключением группы DW со стабильным и самым низким EI из-за отсутствия интактных эритроцитов. При чистом показателе 50 и 100 EI имел дозозависимый характер, при этом EI был значительно выше при 0,5 и 1 мг/мл, чем при 0,01 и 0,1 мг/мл. Хотя при чистом показателе 200 не было статистической разницы в EI между 0,5, 1 и 0,01, 0,1 мг/мл в группе COS-3K, EI в группе COS-5K имел ту же тенденцию, что и при чистом показателе 50 и 100.

Рисунок 5. Деформируемость эритроцитов, обнаруженная с помощью лазерно-дифракционной системы эктацитометра при скорости сдвига 50 (А) , 100 (Б) , 200 (С) , 1000 (D) в присутствии COS с различной концентрацией.

NS, физиологический раствор; ДВ, разбавленная вода. * р < 0,05; ** р < 0,01.

Результаты агрегации эритроцитов соответствовали гемолизу. Как показано на фигуре 6 , при концентрации 1 мг/мл эритроциты имели двояковогнутую форму, и наблюдались некоторые кольца эритроцитов, определяемые как обратимая агрегация, по сравнению с нормальным распределением эритроцитов в группе NS. Однако при повышении концентрации до 5 мг/мл все эритроциты агрегировали, образуя скопления эритроцитов, агрегация которых необратима, а нормальная форма эритроцитов отсутствовала. Как сообщалось в предыдущем сообщении, амидоцианоген хитозана может нейтрализовать отрицательно заряженные остатки нейраминовой кислоты, расположенные на поверхности эритроцитов ( Fernandes et al., 2008 ). Вероятно, положительный заряд COS может изменить распределение заряда и нарушить электрокинетический баланс на поверхности эритроцитов, приводя к дозозависимой агрегации.

Рисунок 6. Фотографии агрегации эритроцитов, индуцированной COS, под оптическим микроскопом.

Положительным контролем служили эритроциты, инкубированные с PEI. PEI, полиэфиримид; НС, физиологический раствор.

Коагуляция

Влияние на коагуляцию является важным свойством биоматериала, поскольку как антикоагулянтные, так и прокоагуляционные действия могут вызывать осложнения у плода или побочные эффекты у человека, такие как кровотечение и образование тромбов ( Чжан и др., 2013 ). Для изучения влияния на коагуляцию в тестах были задействованы АЧТВ, ПВ, ТТ и фибриноген. Его определяют как нарушение гемостатических свойств крови человека при изменении АЧТВ более 10 с или изменении ПВ/ТВ более 3 с ( Yang et al., 2008 ). В нашем исследовании, как показано на рисунке 7А , высокие концентрации (0,5 и 0,1 мг/мл) COS продлевали АЧТВ по сравнению с группой NS ( ) дозозависимым образом, а максимальное АЧТВ даже превышало доступное для машины значение (> 245 с). Напротив, TT был нормальным во всех группах COS (рис. 7B ). Для PT, показанного на фигуре 7C , хотя оно было немного дольше в группе с 0,1 и 0,5 мг/мл, все значения PT находились в нормальном диапазоне при рассмотрении шкалы 3-секундной подвижности. Как и в случае с TT, концентрация Fib в группах COS была равна таковой в группе NS (рис. 7D ). В пределах наших ожиданий в группе гепарина (0,75 МЕ/мл) (положительный контроль ТТ) наблюдалось длительное значение ТТ, превышающее 169 с.

Рисунок 7. Анализ влияния ХОС на коагуляцию

(А) АЧТВ COS и гепарина. (Б) ТТ COS и гепарина. (C) PT COS и гепарина. (D) Концентрация Фиб. ** по сравнению с группой NS; # означает превышение параметра, доступная машина.

NS, физиологический раствор; ХП, гепарин.

АЧТВ и ПВ соответственно отражают состояние внутренней и внешней свертываемости крови, тогда как ТВ используется для проверки влияния на превращение фибриногена в нерастворимый фибрин, индуцируемое тромбином, или наличия антикоагулянта при продлении АЧТВ и ПВ. Наше исследование показало, что COS влияет на внутренний путь свертывания крови из-за увеличения АЧТВ, в то время как ПВ, ТВ и фибриноген находятся в нормальном диапазоне. Насколько нам известно, впервые сообщается, что COS обладает антикоагулянтной активностью за счет блокирования внутреннего пути свертывания крови, который отличается от хитозана прокоагулянтной активностью. С другой стороны, следует отметить, что антикоагулянтная активность КОС мягкая по сравнению с другими антикоагулянтами, например, альгинатными сульфатами, у которых АЧТВ в концентрации 80 мкг/мл увеличивалось на 180 с, тогда как АЧТВ КОС было около 80 с в концентрации 0,1 мг/мл.

Активация комплемента

Активация комплемента является важным показателем гемосовместимости биоматериалов. Система комплемента является врожденной частью иммунной системы и может быть активирована тремя путями: классическим путем, альтернативным путем и лектиновым путем ( Coulthard and Woodruff, 2015 ). После активации системы комплемента C3 расщепляется на фрагменты C3a и C3b и приводит к последующей генерации C5a. Как показано на фигуре 8 , при низкой концентрации COS, по-видимому, индуцировал больше C3a, чем группа NS, чем группа при высокой концентрации. Однако разница не имеет статистической значимости.

Рисунок 8. Влияние COS на систему комплемента.

(A) Концентрация C3a в сыворотке. (B) Концентрация C5a в сыворотке. НС, физиологический раствор.

Предполагается, что хитозан активирует систему комплемента путем истощения или поглощения белков C3 и C5 из сыворотки (Benesch and Tengvall, 2002). Интересно, что в нашем исследовании COS продемонстрировал относительную совместимость комплемента: C3a и C5a во всех группах находились в пределах нормы. Подобно нашим выводам, Marchand et al. сообщили, что хитозан с DD 80% и 95% не активирует систему комплемента, поскольку C3 и C5 связываются с хитозаном как интактные белки (Marchand et al., 2010). Следовательно, DD может быть важным фактором, определяющим, индуцирует ли хитозан активацию комплемента.

Тромбоцит

CD62P, маркер активации тромбоцитов, использовался для исследования влияния COS на тромбоциты. Как показано на фигурах 9А, В, при наличии COS в концентрациях 0,1 и 0,5 мг/мл экспрессия CD62P находилась в нормальном диапазоне (p > 0,05), что указывает на то, что тромбоциты не активировались COS. Гепарин продемонстрировал сильную способность стимулировать тромбоциты, которые CD62P был удивительно высоким в группе гепарина. Что касается агрегации тромбоцитов, снижение агрегации наблюдалось во всех группах COS (p <0,05 для всех COS) по сравнению с физиологическим раствором (рис. 9C). Более того, не было статистически значимой разницы между двумя концентрациями или двумя COS.

Рисунок 9. Анализ влияния COS на тромбоциты:

(A) Проточная цитометрия активированных тромбоцитов. (B) Процент активации тромбоцитов. (C) Влияние на агрегацию тромбоцитов.

НС, физиологический раствор. * р < 0,05.

Тромбоциты были жизненно важным компонентом крови, участвующим в каскаде свертывания крови, и обеспечивали большое количество факторов свертывания крови, таких как фактор тромбоцитов 3 и фактор Va, при активации приводивших к образованию микрочастиц тромбоцитов (Горбет и Сефтон, 2004). В процессе коагуляции индуцированные микрочастицы тромбоцитов способствуют прилипанию тромбоцитов к фибрину, что приводит к скоплению тромбоцитов и противокровотной функции. Согласно результатам коагуляции, COS не активировал тромбоциты и ингибировал агрегацию тромбоцитов, что указывает на то, что он действует как антикоагулянт. При таких концентрациях 0,5 и 0,1 мг/мл COS с двумя молекулярными массами не имеет разницы в способности ингибировать тромбоциты.

Обсуждение механизма

Хитозан, полученный из хитина, представляет собой катионный полисахарид, который широко используется в качестве гемостаза, повязки на раны или антибактериального материала в клинике ( Kumar et al., 2004 ; Muzzarelli et al., 2005 ). Однако применение при контакте с кровью затруднено из-за его плохой совместимости с компонентами крови, такими как прокоагулянтная функция и активация комплемента. Интересно, что здесь было обнаружено, что COS оказывает совершенно иное воздействие на компоненты крови человека, сравнимое с хитозаном (рис. 10 ). Для объяснения этого явления на основе литературы и наших результатов был предложен следующий механизм.

Рисунок 10. Схематическое изображение воздействия хитозана и COS на компоненты крови.

Прокоагулянтная функция хитозана обусловлена его катионной природой, которая индуцируется положительно заряженными аминогруппами, в которых эти группы индуцируют адсорбцию фибриногена, активацию тромбоцитов, высвобождение факторов свертывания крови, а затем запускают внешний путь свертывания крови (Benesch and Tengvall, 2002; Чжан и др., 2013). Однако когда хитозан разлагался до COS, снижение MW приводило к уменьшению локальной плотности положительного заряда и, таким образом, ослабляло электростатистические взаимодействия между положительно заряженными аминогруппами и компонентами крови по сравнению с хитозаном. В случае эритроцитов электростатические взаимодействия приводят к повреждению мембраны, гемолизу, а также агрегации, в то время как для COS-3k и 5k наблюдался низкий риск гемолиза, деформируемости и агрегации в результате снижения MW и плотности положительного заряда. Аналогичным образом, снижение плотности положительного заряда может также снизить прокоагулянтную функцию хитозана. Однако наши результаты показали, что оба COS проявляют умеренную антикоагулянтную активность в зависимости от дозы. Антикоагулянтная активность, вероятно, связана с гидроксильными группами вдоль молекулярных цепей, поскольку было продемонстрировано, что гидроксильные группы способны антикоагулянтно, как сообщалось ранее (Sperling et al., 2005).

Заключение

Таким образом, молекулярная структура двух COS с разной молекулярной массой была охарактеризована с помощью FTIR и ¹H ЯМР, а затем в этой работе было изучено влияние COS на компоненты крови человека, включая эритроциты, систему свертывания крови, комплемент и тромбоциты. работа. Результаты показали, что: (i) COS демонстрировал низкий риск гемолиза в зависимости от дозы и молекулярной массы, а необратимая агрегация наблюдалась при их высоких концентрациях; (ii) COS обладает легкой антикоагулянтной активностью за счет блокирования внутреннего пути свертывания крови; (iii) COS не влияет на активацию комплемента в C3a и C5a; (iv) COS не оказывает влияния на активацию тромбоцитов, хотя ингибирование агрегации тромбоцитов было очевидным. Наконец, механизм действия был обсужден и предложен.

Вклад автора

XG: обсуждение результатов, написание статьи и оценка гемосовместимости. ТС: обсуждение результатов, оценка гемосовместимости. РЗ: оценка гемосовместимости, статистический анализ. ЛМ: обсуждение результатов. CY: оценка результатов исследования. MT: дизайн изделия, ЯМР-спектроскопия и характеристика FTIR. HL и CW: обсуждение результатов, статистический анализ.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81401528, 51403238), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (№ YS2018YFA010082), Ключевым научно-техническим проектом провинции Сычуань (№ 2018SZ0029, 2018SZ0100, 2015SZ0051). ) и проект 1.3.5 по передовым дисциплинам, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет (№ ZY2016102 и ZY2016203).

Рекомендации

Бай, М.И., Тан, С.Л., Чуанг, М.Х., Ван, Тай, и Хонг, П.Д. (2018). Оценка микрочастиц производного хитозана, инкапсулирующих суперпарамагнитный оксид железа и доксорубицин, в качестве рН-чувствительного носителя для доставки при лечении карциномы печени: сравнительное исследование in vitro. Передний. Фармакол. 9:1025. дои: 10.3389/fhar.2018.01025 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Бенеш Дж. и Тенгвалл П. (2002). Адсорбция белков крови на хитозане. Биоматериалы 23, 2561–2568. doi: 10.1016/S0142-9612(01)00391-X · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Че, С.Ю., Чан, МК, и На, Дж.В. (2005). Влияние молекулярной массы на пероральную абсорбцию водорастворимых хитозанов. Дж. Контроль. Выпуск 102, 383–394. doi: 10.1016/j.jconrel.2004.10.012 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чен Ю., Ли Дж., Ли К., Шен Ю., Ге З., Чжан В. и др. (2016). Повышение водорастворимости, антибактериальной активности и биосовместимости при введении в хитозан сульфобетаина и четвертичного аммония. Углевод. Полим. 143, 246–253. doi: 10.1016/j.carbpol.2016.01.073 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чен З., Яо Х., Лю Л., Гуань Дж., Лю М., Ли З. и др. (2017). Оценка свертываемости крови N-алкилированного хитозана. Углевод. Полим. 173, 259–268. doi: 10.1016/j.carbpol.2017.05.085 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Култхард, Л.Г. и Вудрафф, Т.М. (2015). Является ли продукт активации комплемента C3a провоспалительной молекулой? Переоценка фактов и мифов. Дж. Иммунол. 194, 3542–3548. doi: 10.4049/jimmunol.1403068 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Дин Б., Ю К., Ли К., Дэн К., Дин Дж., Ченг З. и др. (2017). Нанопластины CuFeS2 с цис-платиновым пролекарством для фототермической/фотоакустической визуализации in vivo и химиотерапии/фототермической терапии рака. Наномасштаб 9, 16937–16949. doi: 10.1039/C7NR04166G · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Эль-Сайед Н.С., Шарма М., Алиабади Х.М., Эль-Мелиджи М.Г., Эль-Заити А.К., Нагеиб З.А. и др. (2018). Синтез, характеристика и цитотоксичность in vitro конъюгатов жирных ацил-CGKRK-хитозан-олигосахаридов для доставки миРНК. Межд. Ж. Биол. Макромол. 112, 694–702. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.01.213 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Фернандес Дж.К., Итон П., Насименто Х., Бело Л., Роча С., Виторино Р. и др. (2008). Влияние хитоолигосахаридов на морфологию эритроцитов человека и структуру мембранных белков. Биомакромолекулы 9, 3346–3352. дои: 10.1021/bm800622f · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Горбет, М.Б. и Сефтон, М.В. (2004). Тромбоз, связанный с биоматериалом: роль факторов свертывания крови, комплемента, тромбоцитов и лейкоцитов. Биоматериалы 25, 5681–5703. doi: 10.1016/j.bimaterials.2004.01.023 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Хуанг Б., Сяо Д., Тан Б., Сяо Х., Ван Дж., Инь Дж. и др. (2016). Олигосахарид хитозана уменьшает воспаление кишечника, которое включает активацию кальций-чувствительного рецептора (CaSR) у поросят, зараженных липополисахаридом (ЛПС). Дж. Агрик. Пищевая хим. 64, 245–252. doi: 10.1021/acs.jafc.5b05195 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Калагатур, Н.К., Нирмал Гош, О.С., Сундарарадж, Н., и Мудили, В. (2018). Противогрибковая активность наночастиц хитозана, инкапсулированных эфирным маслом cymbopogon martinii, на фитопатогенные грибы Fusarium graminearum. Передний. Фармакол. 9:610. дои: 10.3389/fphar.2018.00610 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Кумар, Миннесота, Муцарелли, Р.А., Муцарелли, К., Сашива, Х. и Домб, А.Дж. (2004). Химия хитозана и фармацевтические перспективы. хим. Откр. 104, 6017–6084. дои: 10.1021/cr030441b · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Кунанусорнчай В., Витунпанич Б., Тавонсаватрук Т., Пичьянгкура Р., Чацудтипонг В. и Муанпрасат К. (2016). Олигосахарид хитозана подавляет синовиальное воспаление посредством активации AMPK: исследование in vitro и in vivo. Фармакол. Рез. 113, 458–467. doi: 10.1016/J.phrs.2016.09.016 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Ли, Дж.Й., Термсарасаб, У., Ли, М.Ю., Ким, Д.Х., Ли, С.Ю., Ким, Дж.С. и др. (2017). Хемосенсибилизирующие наночастицы хитозан-олигосахарида, конъюгированные с индометацином, для доставки лекарств, нацеленных на опухоли. Акта Биоматер. 57, 262–273. doi: 10.1016/j.actbio.2017.05.012 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Льюис, врач общей практики (1965). Метод с использованием ортотолидина для количественного определения гемоглобина в сыворотке крови и моче. Дж. Клин. Патол. 18, 235–239. дои: 10.1136/jcp.18.2.235 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Лин, К.В., и Лин, Дж.К. (2003). Характеристика и оценка свертываемости крови водорастворимых хитоолигосахаридов, полученных методом простого фракционирования. Биомакромолекулы 4, 1691–1697. дои: 10.1021/bm034129n · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Лю, HT, Ли, WM, Сюй, Г., Ли, XY, Бай, XF, Вэй, П. и др. (2009). Олигосахариды хитозана ослабляют стрессовое повреждение, вызванное перекисью водорода, в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Фармакол. Рез. 59, 167–175. doi: 10.1016/j.phrs.2008.12.001 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Лу Ю., Шах А., Хантер Р.А., Сото Р.Дж. и Шенфиш М.Х. (2015). S-нитрозотиол-модифицированные олигосахариды хитозана, высвобождающие оксид азота, в качестве антибактериальных средств. Акта Биоматер. 12, 62–69. doi: 10.1016/j.actbio.2014.10.028 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Лу Ю., Сломберг Д.Л. и Шенфиш М.Х. (2014). Хитозан-олигосахариды, высвобождающие оксид азота, как антибактериальные средства. Биоматериалы 35, 1716–1724. doi: 10.1016/j.bimaterials.2013.11.015 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Маршан К., Бачанд Ж., Перине Ж., Барагис Э., Ламарр М., Ривар Дж. Е. и др. (2010). C3, C5 и фактор B связываются с хитозаном без активации комплемента. Дж. Биомед. Матер. Рез. А 93, 1429–1441. дои: 10.1002/jbm.a.32638 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Маттавеевонг Т., Вонгкрасант П., Чанчай С., Пичьянгкура Р., Чацудтипонг В. и Муанпрасат К. (2016). Олигосахарид хитозана подавляет прогрессирование опухоли на мышиной модели колоректального рака, связанного с колитом, посредством активации AMPK и подавления передачи сигналов NF-kappaB и mTOR. Углевод. Полим. 145, 30–36. doi: 10.1016/j.carbpol.2016.02.077 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Муанпрасат, К., и Чацудтипонг, В. (2017). Олигосахарид хитозана: биологическая активность и потенциальное терапевтическое применение. Фармакол. Там. 170, 80–97. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.10.013 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Музцарелли Р.А., Геррьери М., Готери Г., Муцарелли К., Армени Т., Гизелли Р. и др. (2005). Биосовместимость дибутирилхитина в контексте раневых повязок. Биоматериалы 26, 5844–5854. doi: 10.1016/j.bimaterials.2005.03.006 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Нан В., Дин Л., Чен Х., Хан ФУ, Ю Л., Суй X. и др. (2018). Местное использование наночастиц хитозана, нагруженных кверцетином, против ультрафиолетового излучения B. Передний. Фармакол. 9:826. дои: 10.3389/fphar.2018.00826 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Никитина Л.Е., Киселев С.В., Старцева В.А., Бодров А.В., Азизова З.Р., Шипина О.Т. и др. (2018). Серосодержащие монотерпеноиды как потенциальные антитромботические препараты: исследование молекулярного механизма коагуляционной активности на примере пинанилсульфоксида. Передний. Фармакол. 9:116. дои: 10.3389/fhar.2018.00116 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Рао, С.Б. и Шарма, К.П. (1997). Использование хитозана в качестве биоматериала: исследования его безопасности и гемостатического потенциала. Дж. Биомед. Матер. Рез. 34, 21–28. doi: 10.1002/(SICI)1097-4636(199701)34:1<21::AID-JBM4>3.0.CO;2-P · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Сперлинг К., Швайс Р.Б., Стреллер У. и Вернер К. (2005). Гемосовместимость in vitro самоорганизующихся монослоев с различными функциональными группами. Биоматериалы 26, 6547–6557. doi: 10.1016/j.bimaterials.2005.04.042 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Святкевич С., Святкевич М., Арчевска-Влосек А. и Йозефиак Д. (2015). Хитозан и его олигосахаридные производные (хитоолигосахариды) в качестве кормовой добавки в питании птицы и свиней. Дж. Аним. Физиол. Аним. Нутр. 99, 1–12. дои: 10.1111/яп.12222 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Тромботто С., Ладавьер К., Делольм Ф. и Домар А. (2008). Химическое получение и структурная характеристика гомогенного ряда олигомеров хитина/хитозана. Биомакромолекулы 9, 1731–1738. дои: 10.1021/bm800157x · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Вебер М., Стейнле Х., Голомбек С., Ханн Л., Шленсак К., Вендель Х. и др. (2018). Биоматериалы, контактирующие с кровью: оценка гемосовместимости. Передний. Биоинж. Биотехнология. 6:99. doi: 10.3389/fbioe.2018.00099 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Ву Т., Ву К., Фу С., Ван Л., Юань К., Чен С. и др. (2017). Интеграция лизоцима в наночастицы хитозана для улучшения антибактериальной активности. Углевод. Полим. 155, 192–200. doi: 10.1016/j.carbpol.2016.08.076 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Ян Дж., Тянь Ф., Ван З., Ван К., Цзэн Ю.Дж. и Чен С.К. (2008). Влияние молекулярной массы хитозана и степени деацетилирования на гемостаз. Дж. Биомед. Матер. Рез. Приложение части B. Биоматер. 84, 131–137. дои: 10.1002/jbm.b.30853 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чжан Г., Цзя П., Лю Х., Ху Т. и Ду Ю. (2018). Конъюгация олигосахаридов хитозана усиливает иммунный ответ на вакцину против цирковируса свиней за счет активации макрофагов. Иммунобиология 223, 663–670. дои: 10.1016/j.imbio.2018.07.012 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чжан П., Лю В., Пэн Ю., Хань Б. и Ян Ю. (2014). Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) опосредует стимулирующую активность олигосахарида хитозана на макрофагах. Межд. Иммунофармакол. 23, 254–261. doi: 10.1016/j.intimp.2014.09.007 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чжан В., Чжун Д., Лю К., Чжан Ю., Ли Н., Ван К. и др. (2013). Влияние хитозана и карбоксиметилхитозана на структуру фибриногена и свертывание крови. Дж. Биоматер. наук. Полим. Эд. 24, 1549–1563. дои: 10.1080/09205063.2013.777229 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чжао Л., Ю Г., Ляо Ф., Кан Х., Ван Б., Сунь Ц. и др. (2010). Альгинат натрия как модификатор вязкости может вызывать агрегацию эритроцитов. Артиф. Клеточные кровезаменители. Неподвижен. Биотехнология. 38, 267–276. дои: 10.3109/10731191003776736 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Чжун Р., Ван Х., Ву Х., Цао Ю., Хэ З., Хэ Ю. и др. (2013). Исследование in vitro влияния пластификаторов на совместимость с кровью пластифицированного поливинилхлорида медицинского назначения. Дж. Матер. наук. Матер. Мед. 24, 1985–1992. дои: 10.1007/s10856-013-4950-1 · PubMed Аннотация · Полный текст CrossRef · Google Scholar

Ключевые слова: олигосахарид хитозана (COS), эритроциты (RBC), коагуляция, комплемент, тромбоциты.

Цитирование: Го X, Сунь Т, Чжун Р, Ма Л, Ю С, Тянь М, Ли Х и Ван С (2018) Влияние олигосахаридов хитозана на компоненты крови человека. Передний. Фармакол. 9:1412. дои: 10.3389/fphar.2018.01412

Поступила: 19 октября 2018 г.; Принято: 16 ноября 2018 г.;

Опубликовано: 3 декабря 2018 г.

Отредактировано: · Цзяньсюнь Дин

, Чанчуньский институт прикладной химии (CAS), Китай

Рассмотрено: · Шиго Чен

, Шэньчжэньский университет, Китай · Цзянь Чжун

, Шанхайский океанический университет, Китай

Авторские права © 2018 Го, Сунь, Чжун, Ма, Ю, Тянь, Ли и Ван. Это статья в открытом доступе, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY). Использование, распространение или воспроизведение на других форумах разрешено при условии, что указаны первоначальный автор(ы) и владелец(и) авторских прав и что оригинальная публикация в этом журнале цитируется в соответствии с принятой академической практикой. Никакое использование, распространение или воспроизведение, не соответствующее этим условиям, не допускается.

*Переписка: Мэн Тянь, 6744710@qq.com; tianmong007@gmail.com

Хао Ли,

coscolh@126.com

Чэнвэй Ван, 21270526@qq.com

Отказ от ответственности: все претензии, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, сделанное его производителем, не гарантируется и не одобряется издателем.