Влияние олигосахаридов хитозана на компоненты крови человека

23 апреля 2024
  • 1 отделение нейрохирургии, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай
  • 2 Исследовательская лаборатория нейрохирургии, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай
  • 3 Институт переливания крови Китайской академии медицинских наук и Медицинского колледжа Пекинского союза, Чэнду, Китай
  • 4 Западно-Китайский центр исследования мозга, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай
  • 5 Отделение интегрированной традиционной и западной медицины, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай

Хитозан олигосахарид (COS) известен своей уникальной биологической активностью, такой как противоопухолевая, противовоспалительная, антиоксидантная, антибактериальная активность, биологическое распознавание и эффекты усиления иммунитета, и, таким образом, постоянно привлекает множество исследовательских интересов в области лекарств, продуктов питания. , косметика, биоматериалы и тканевая инженерия. По сравнению с соответствующим полимером COS имеет гораздо более высокие профили абсорбции на уровне кишечника, что обеспечивает быстрый доступ к кровотоку и потенциальный контакт с компонентами крови. Однако влияние COS на компоненты крови до сих пор остается неясным. Здесь два COS с разной молекулярной массой (ММ) были охарактеризованы методами FTIR и 1 H ЯМР, а затем их влияние на компоненты крови человека, включая эритроциты (эритроциты) (гемолиз, деформируемость и агрегация), систему свертывания крови [активированная частичная Всесторонне изучались тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ), концентрация фибриногена (Фиб)], комплемента (активация С3а и С5а) и тромбоцитов (активация и агрегация). В случае эритроцитов COS демонстрировал низкий риск гемолиза в зависимости от дозы и молекулярной массы, а необратимая агрегация наблюдалась при их высоких концентрациях. В отношении системы свертывания крови COS обладает легкой антикоагулянтной активностью за счет блокирования внутреннего пути свертывания крови. Кроме того, COS не оказал влияния на активацию комплемента в C3a и C5a и на активацию тромбоцитов, хотя ингибирование агрегации тромбоцитов было очевидным. Наконец, был обсужден и предложен механизм воздействия COS на компоненты крови.

Введение

Олигосахарид хитозана (COS) представляет собой олигомер хитозана со средней молекулярной массой (ММ) < 5000 Да, его химическая структура, как и у хитозана, представляет собой линейный бинарный сополимер, состоящий из β-1,4-связанного 2-ацетамидо-2- дезокси-β-D-глюкопираноза (GlcNAc) и 2-амино-2-дезокси-β-D-глюкопираноза (GlcN) ( Kumar et al., 2004 ; Muanprasat and Chatsudthipong, 2017 ). Большой исследовательский интерес к этому олигомеру обусловлен не только его физико-химическими свойствами, такими как лучшая растворимость в воде и катионная природа при нейтральном pH, но также и его биологической активностью, например, противоопухолевой, противовоспалительной, антиоксидантной, противовоспалительной. -бактериальная активность, биологическое распознавание и эффекты усиления иммунитета ( Liu et al., 2009 ; Lu et al., 2014 , 2015 ; Zhang et al., 2014 , 2018 ; Huang et al., 2016 ; Kunanusornchai et al., 2016). Мэттавевонг и др., 2016 ; Динг и др. , 2017 ; Эти уникальные свойства и деятельность постоянно привлекают внимание многих исследователей в области лекарств, продуктов питания, косметики, биоматериалов и тканевой инженерии ( Swiatkiewicz et al., 2015 ; Lee et al., 2017 ; Bai et al., 2018 ; El-Sayed et al. , 2018 ; Нан и др., 2018 ).

Хотя использование COS расширилось во многих исследовательских и прикладных областях, существуют некоторые дилеммы, которые необходимо прояснить. Например, хорошо известно, что пероральное введение COS имеет гораздо более высокие профили абсорбции на уровне кишечника, чем у его соответствующего полимера хитозана, что приводит к его быстрому доступу в кровоток и потенциальному контакту с компонентами крови ( Chae и др., 2005 ). Это также применимо к тканеинженерным каркасам на основе хитозана, поскольку деградированные фрагменты, состоящие в основном из COS, в конечном итоге попадут в кровообращение. По этим причинам необходимо учитывать влияние COS на кровь, такие как ее основные компоненты, включая эритроциты (эритроциты), коагуляцию, адсорбцию белка, комплемент и тромбоциты, поскольку гемосовместимость COS не изучена. сообщалось на сегодняшний день. В целом, хитозан образовывал коагулят при контакте с цельной кровью, где тромбоциты демонстрировали отчетливую адгезию к его поверхности в течение короткого времени, а время свертывания, как сообщалось, сокращалось на 40% по сравнению с цельной кровью ( Rao and Sharma, 1997 ; Chen et al.) . др., 2017 ). В результате хитозан обычно используется в качестве кровоостанавливающей повязки для заживления ран в клинике, а не в качестве медицинского устройства, контактирующего с кровью ( Muzzarelli et al., 2005 ). Гемостатические свойства объясняются поликатионными свойствами хитозана и его неспецифическим связыванием с клеточными мембранами за счет положительно заряженных аминогрупп вдоль молекулярных цепей ( Benesch and Tengvall, 2002 ). Однако в случае COS наблюдались некоторые другие явления. Лин и др. сравнили время свертывания цельной крови COS и хитозана и обнаружили, что первый не оказывает гемостатического эффекта ( Lin and Lin, 2003 ). Аналогично, Фернандес и др. изучили взаимодействие COS с эритроцитами человека, и результаты показали, что значительного гемолиза не наблюдалось, а повреждение COS эритроцитов зависело от концентрации и молекулярной массы использованных образцов ( Fernandes et al., 2008 ). Вышеупомянутые отчеты показали, что COS, по-видимому, обладает лучшей гемосовместимостью, чем хитозан. Помимо положительно заряженных аминогрупп, в молекулярных цепях COS имеются многочисленные гидроксильные группы.Предыдущие исследования влияния функциональных групп, таких как гидроксильные, карбоксильные и аминогруппы, на компоненты крови показали, что гидроксильные группы приводят к легкому антикоагуляция, а также активация комплемента, несмотря на отсутствие сообщений о COS ( Sperling et al., 2005 ). В связи с этим можно ожидать, что гидроксильные группы молекулярных цепей COS, вероятно, также оказывают определенное специфическое влияние на компоненты крови.

Мы предполагаем, что COS будет влиять на компоненты крови иным образом, чем хитозан, что может быть связано с его молекулярной массой и функциональными группами вдоль молекулярных цепей. Чтобы опровергнуть эту гипотезу, в этой работе было всесторонне исследовано влияние COS с двумя разными молекулярными массами на компоненты крови человека (рис. 1 ). В частности, влияние COS на эритроциты включало гемолиз, деформируемость и агрегацию; свертывание крови оценивали по времени свертывания, включая протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и тромбиновое время (ТТ), а также концентрацию фибриногена (Фиб); для системы комплемента рассматривали комплемент 3a (C3a) и 5a (C5a) с использованием метода ELISA; а в отношении тромбоцитов определяли активацию и агрегацию тромбоцитов. На основании приведенных выше результатов был обсужден и предложен механизм действия.


Рисунок 1. Схематическое представление COS и компонентов крови.


Материалы и методы

Подготовка материалов

Два образца COS с различной молекулярной массой, 3 (COS-3K) и 5 (COS-5K) кДа, были приобретены у Zhejiang Aoxing Biotechnology Co., Ltd. (Чжэцзян, Китай). Оба образца были получены путем ферментативного гидролиза хитозана, полученного из панцирей крабов. ПЭИ и гепарин натрия были приобретены у Aladdin Co., Ltd. (Чэнду, Китай). Наборы для коагуляции были приобретены у Union Bio-tech Co., Ltd. (Чэнду, Китай). Набор ELISA Kit II был приобретен у Becton-Dickinson Co., Ltd (США). Агенты, связанные с проточной цитометрией, изотиоцианат анти-CD61-флуорецеина (FITC) и анти-CD62p-фикоэритрин (PE) были приобретены у BD Pharmingen, BD Bioscience Co., Ltd. Аденозиндифосфат и адреналин, которые были индукторами агрегации тромбоцитов, были приобретены у Kelong Co., Ltd. (Чэнду, Китай). COS-3K/5K смешивали с физиологическим раствором для получения исходного раствора COS.

Характеристика структуры

Структура двух COS была охарактеризована с помощью инфракрасных спектров Фурье-преобразования (FTIR) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса 1 H (ЯМР). FTIR-анализ COS записывали с помощью прессованных таблеток KBr на ИК-Фурье-спектрометре Nicolet 670. Анализы 1 H ЯМР записывали на спектрометре Bruker AV II400 МГц. DD рассчитывали методом 1 H ЯМР по уравнению (1), где «A CH3 » и «A GlcNH-2 » соответственно соответствуют интегралу сигнала протона N-ацетила и сигнала протона H-2 единиц GlcN.

Сбор крови

Исследование было одобрено Этическим комитетом Института переливания крови Китайской академии медицинских наук и Медицинского колледжа Пекинского союза. Образцы цельной крови с антикоагулянтом (3,8% цитрат натрия/кровь 1:9) и свежезамороженной плазмы (СЗП), антикоагулированной цитрат-фосфат-аденином, использованные в этом исследовании, были получены из Центра крови Чэнду. Для тестов на эритроциты суспензию эритроцитов получали путем трехкратной промывки антикоагулянтной цельной крови физиологическим раствором и последующего доведения гематокрита (HCT) до 10%. Образцы цельной крови центрифугировали при 1200 g в течение 20 минут при 4°C для получения плазмы, бедной тромбоцитами (PPP), и при 150 g в течение 10 минут при 4°C для получения плазмы, богатой тромбоцитами (PRP).

Красные кровяные клетки

Гемолиз

Промытую суспензию эритроцитов с 10% HCT (270 мкл) смешивали с раствором COS-3K/5K (30 мкл) до получения конечной концентрации COS 0,01, 0,1, 0,5, 1 мг/мл. Затем смеси осторожно центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин после 1 ч инкубации при 37°С. Супернатант (0,02 мл), полученный после центрифугирования, добавляли к раствору ортотолидина (1 мл; 0,2 г в 60 мл уксусной кислоты) и перекиси водорода (1 мл; 1 г/л). После инкубации в течение 10 мин реакцию останавливали смешиванием с уксусной кислотой (10 мл; 10%). Спектрофотометр использовали для измерения оптической плотности при длине волны 435 нм. Стандартный раствор гемоглобина с концентрацией 100 мг/л использовали в качестве стандартного контроля, а разбавленную воду (ДВ) использовали в качестве контроля гемолиза. Чтобы выяснить степень гемолиза, использовали следующее уравнение ( Lewis, 1965 ).

А 1 означает оптическую плотность (435 нм) образца; A S означает оптическую плотность стандартного образца (100 мг/л); Hct (%) означает гематокрит; C Hb означает концентрацию гемоглобина.

Деформируемость

Для измерения деформируемости эритроцитов промытую суспензию эритроцитов (270 мкл) инкубировали с исходным раствором COS (30 мкл) до достижения конечной концентрации 0,01, 0,1, 0,5 и 1 мг/мл. После инкубации в течение 1 ч суспензию центрифугировали при 1500 g в течение 4 мин, а затем осторожно смешивали осадок с 1 мл раствора поливинилпирролидона (15% в PBS). Использовали систему лазерной дифракции эктацитометра (LBY-BX, Beijing Pencil Instrument Co., Ltd, Китай). В систему добавляли около 0,5 мл смеси и подвергали сдвигу между двумя концентрическими цилиндрами машины, в которых размер зазора составлял 0,5 мм, при четырех различных напряжениях сдвига: 0,39, 0,77, 1,54 и 7,7 Па (соответствующих сдвиговому напряжению). скорости 50, 100, 200 и 1000) при 37°С. Затем параметр был представлен системой как индекс удлинения (EI) посредством измерения дифракции проходящего лазера. В качестве стандартного и положительного контроля соответственно использовали физиологический раствор и разбавленную воду, смешанную с суспензией эритроцитов.

Агрегация

Чтобы определить, может ли COS приводить к агрегации эритроцитов, образцы цельной крови с антикоагулянтом (270 мкл) смешивали с исходным раствором COS (30 мкл) до достижения конечной концентрации 1 и 5 мг/мл в течение 1 часа инкубации. Затем смеси центрифугировали при 1000 g в течение 3 минут. Осадок (3 мкл) и надосадочную жидкость (40 мкл) осторожно перемешивали и смеси (4 мкл) превращали в предметные стекла. Изображения слайдов были сняты цифровой камерой микроскопа. В качестве положительного контроля использовался полиэфиримид (ПЭИ), который может приводить к очевидной агрегации эритроцитов, а в качестве стандартного контроля использовался физиологический раствор.

Коагуляция

Активированное частичное тромбиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и концентрацию фибриногена (Фиб) измеряли для определения влияния COS на систему свертывания крови с помощью модифицированной стратегии в соответствии с предыдущим исследованием ( Никитина и др.). ., 2018 ). Вкратце, исходный раствор COS (60 мкл) смешивали с FFP (540 мкл) до достижения конечной концентрации 0,01, 0,1 и 0,5 мг/мл, а затем инкубировали при 37°C в течение 3 минут. Для тестирования инкубированного СЗП использовали анализатор коагуляции (Instrumentation Laboratory ACL ELITE, США). Диапазон параметров, доступный для аппарата, составляет от 6 до 245 с для APTT, от 5 до 165 с для PT и от 3 до 169 с для TT. NS использовали в качестве стандартного контроля, а гепарин (HP, конечная концентрация 0,75 МЕ/мл) использовали в качестве положительного контроля. Значения вышеуказанных тестов коагуляции были средними по трем измерениям, а результаты выражались как среднее ± стандартное отклонение (SD).

Дополнить

Активация комплемента отражает влияние COS на систему комплемента. Мы сосредоточились на активации человеческого комплемента C3 и C5 в кровообращении и измерили их расщепленные фрагменты C3a и C5a. Метод измерения следовал стандартному протоколу ELISA Kit II (Becton-Dickinson Co., Ltd, США). Вкратце, сыворотку (90 мкл) инкубировали с COS (конечная концентрация 0,1 и 1 мг/мл) при 37°C в течение 1 часа. Затем инкубированную сыворотку (100 мкл) и стандартный раствор (100 мкл) набора соответственно смешивали с разведением ИФА (50 мкл) в покрытых антителами хорошо запечатанных образцах при комнатной температуре в течение 2 часов. После этого лунки промывали и добавляли детектирующие антитела и ферментный концентрат из набора для инкубации в течение 1 часа. Наконец, лунки считывали и измеряли поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра (EON, Bio-Tech CO., Ltd, США). Концентрацию С3а и С5а рассчитывали по стандартной кривой стандартных образцов набора.

Тромбоцит

Активация

В этом тесте были задействованы CD61, специфический маркер поверхности тромбоцитов, и CD62p, маркер активированных тромбоцитов. Богатую тромбоцитами плазму (PRP) (90 мкл) инкубировали с исходным раствором COS (10 мкл) при 37°C в течение 1 часа до получения конечной концентрации 0,1 и 0,5 мг/мл. Инкубированную PRP (5 мкл) смешивали с изотиоцианатом анти-CD61-флуоресцеина (5 мкл), анти-CD62p-фикоэритрином (5 мкл) и буфером PBS (10 мМ, 40 мкл) в темноте в течение 15 минут, а затем добавляли 400 мкл. буфера PBS. Проточную цитометрию (Becton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США) использовали для измерения количества тромбоцитов, экспрессирующих CD62p. В качестве нормального контроля и положительного контроля использовали физиологический раствор и тромбин (10 ед./мл) соответственно ( Zong et al., 2013 ).

Агрегация

Чтобы выяснить, влияет ли COS на агрегацию тромбоцитов, PRP (270 мкл) инкубировали с исходным раствором COS (30 мкл) при 37°C в течение 1 часа. После инкубации мы добавили аденозиндифосфат (0,1 мМ, 12,5 мкл) и адреналин (0,15 мМ, 12,5 мкл) к инкубированной PRP, чтобы вызвать агрегацию тромбоцитов. Для измерения степени агрегации использовали агрегометрию (MODEL700, CHRONO-LOG CO. LTD, США). В качестве контрольных групп использовали PRP, инкубированные с физиологическим раствором и тромбином (10 ЕД/мл).

Статистический анализ

Все результаты были описаны как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ всех данных проводился с использованием SPSS 19 (IBM, Statistic Package for Social Science). Статистически значимым считалось значение р <0,05.

Результаты и обсуждения

Структурная характеристика COS

Спектры FTIR двух COS показаны на рисунке 2 , оба из которых демонстрируют характерные поглощения, аналогичные таковым у хитозанов с высоким DD, как сообщалось ранее. Полоса поглощения около 3430 см -1 отнесена к валентным колебаниям NH и OH ( Chen et al., 2016 ; Wu et al., 2017 ). Пики при 2880 и 2930 см -1 относятся к валентным колебаниям CH, а пики при 1650, 1630 и 1320 см -1 – к амидам I, II и III соответственно. Полоса при 1380 соответствует деформационным и валентным колебаниям CH, а полосы в диапазоне 1150–890 относятся к особенностям его полисахаридной структуры. Как сообщалось в предыдущей литературе, COS, полученный с помощью подходов к химической деградации, таких как окислительная деградация перекисью водорода, показал ослабленную амидную полосу I из-за H-абстракции у C-1 и C-2 во время деградации, что оба привело к частичному дезаминированию. Однако два образца COS в этом исследовании, полученные ферментативным гидролизом, по-прежнему демонстрируют сильную амидную полосу I, что указывает на то, что оба образца COS являются продуктами разложения с высоким DD.


Рисунок 2. FTIR-спектры двух COS.

Химическую структуру двух образцов COS дополнительно изучали методом 1 H ЯМР. Как показано на фигуре 3 , два образца демонстрировали схожий спектр 1 H ЯМР. Согласно предыдущим литературным данным, сигналы при 2,0 и 3,1 м.д. относятся к протонам CH3 и H-2 GlcN соответственно. В слабом поле сигналы при 3,5–4,0 м.д. относят к H-3, 4, 5, 6 GlcN и H-2, 3, 4, 5, 6 GlcNAc, а сигналы при 4,5 м.д. – к H-1 GlcN ( Тромботто и др., 2008 ). По сравнению со спектром 1 H ЯМР хитозана, как сообщалось ранее, для двух образцов нет существенной разницы. Кроме того, значения DD для двух образцов рассчитывали по спектру ЯМР 1 Н согласно уравнению (1). Рассчитанные DD составили 88,4 и 87,4% для COS-5K и COS-3K соответственно, что согласуется с результатами FTIR.


Рис. 3. Спектры ЯМР 1 Н двух COS