ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХИТОЗАНА В ПРОИЗВОДСТВЕ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

4 декабря 2017

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХИТОЗАНА В ПРОИЗВОДСТВЕ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Т.В. Буткевич, В.П. Варламов, И.А. Евдокимов, Л.Р. Алиева, В.П. Курченко

Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия Северо-Кавказский государственный технический университет, Ставрополь, Россия kurchenko@tut.by

Введение:

В последние годы ведутся интенсивные исследования по оценке возможности использования хитозана при производстве функциональных продуктов питания. Это связано с биологическими свойствами данного биополимера. Он биосовместим и биоразрушаем до обычных для организма веществ (N-ацетилглюкозамин или глюкозамин), обладает иммуномодулирующим, противомикробным, фунистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, противовоспалительным, ранозаживляющим, антихолестерическим, гемостатическим действием и при этом он малотоксичен [1]. Хитозан можно отнести к группе парафармацевтиков – природных веществ, обладающих специфической фармакологической активностью. Во многих странах мира одобрено его применение в качестве биологически активной добавки к пище [2]. Для применения хитозана в качестве пищевых добавок важны такие его свойства, как сочетание безвредности и биологической активности. Особое значение придается липотропному действию хитозана, как важному фактору, способствующему противостоянию сердечнососудистой патологии. При изучении влияния хитозана на липидный обмен обнаружено достоверное снижение содержания общих липидов, триглицеридов, холестерина в сыворотке крови, увеличение уровня глюкозы и снижение содержания пировиноградной кислоты, свидетельствующие о позитивном влиянии на углеводный обмен, а также достоверное снижение активности аминотрансфераз сыворотки крови, что свидетельствует о положительном влиянии хитозана на функцию печени [3]. Весьма полезными качествами хитозана при использовании его в пищевых целях являются сорбционные свойства и способность восстанавливать микрофлору кишечника. Первичные аминогруппы хитозана либо его комплексов обеспечивают связывание тяжелых металлов и радионуклидов, в десятки раз превосходя по эффективности ионообменные смолы. Способность хитозана образовывать полиэлектролитные комплексы с анионными полимерами может использоваться для связывания и выведения из организма различных токсинов [4]. Механизм действия хитозана на патогенную микробную флору предположительно связывают с нарушением целостности их наружной мембраны, в состав которой входят липополисахариды, гликопротеиды, фосфолипиды. Нарушение защитной микробной оболочки способствует большей уязвимости микроорганизма и повышению его чувствительности к антибиотикам. Показано, что хитозан повышает неспецифическую резистентность организма к действию неблагоприятных факторов среды. Кроме того, он обладает способностью стимулировать рост бифидобактерий и полезной кишечной флоры. Многочисленными исследованиями доказаны его противоопухолевые свойства. За время многолетней клинической практики противопоказаний к биологически активным добавкам к пище на основе хитозана не было обнаружено. При аллергии на рыбные продукты применять препарат нужно с осторожностью. Применение хитозана может быть ограничено лишь при повышенной кислотности, обострении гастрита и язвенных заболеваниях. Хитозан – один из немногих энтеросорбентов, который получил глубокое и достаточно разностороннее медико-биологическое обоснование безопасности и лечебнопрофилактических эффектов [1].

Механизм взаимодействия хитозана с белками молока

Важным свойством этого полисахарида является способность взаимодействовать с белками, образовывать эмульсии, гели, выступать в качестве стабилизатора и антиоксиданта [5]. В молочной промышленности при производстве рядов продуктов (лактозы, сиропов, напитков) необходимо удаление белков из молочной сыворотки. При коагуляции сывороточных белков с успехом может быть использован хитозан. Растворяется хитозан в минеральных и органических кислотах. При значении рН выше 7 аминогруппа депротонирована и проявляет нуклеофильные свойства. Неподеленная электронная пара обуславливает возможность образования связей с противоположно заряженными группами ряда соединений, в том числе, альдегидов, некоторых кислот, кислых ангидридов, эпоксидных смол. На этом свойстве хитозана основано получение водорастворимых (при рН 7) производных хитозана, в том числе сукцината хитозана. При низких значениях рН (рКа<6,5) аминогруппа протонирована, хитозан представляет собой катионный водорастворимый полиэлектролит. Благодаря своей химической природе он способен к различным видам взаимодействия, с образованием 4 основных типов связей: ионных, водородных, гидрофобных, связей по типу комплексообразования, в котором хитозан выступает в роли ядра комплекса. Ионные взаимодействия происходят за счет аминогруппы. Слабые связи (водородные, гидрофобные) образуются при взаимодействии хитозана с рядом органических веществ [6]. По литературным данным на этом принципе основана сорбция хитозаном фенола. Связь здесь образуется за счет ОН-группы фенола и ацетамидной группировки хитозана. Этот же тип взаимодействия наблюдается при введении избытка хитозана в раствор коллагена. Способность хитозана к комплексообразованию обусловлена наличием неподеленных электронных пар у атома азота и, в ряде случаев, связи образуются за счет неподеленных электронных пар атома кислорода. На этом принципе основано образование многочисленных связей хелатного типа с металлами. Хитозан способен образовывать подобные связи при определенных условиях со всеми металлами за исключением щелочных и щелочно-земельных. Реакция комплексообразования возможна не только в растворах, но и в твердых средах [4]. Также по данному типу связи возможно разделение молочного сырья на белковую и безбелковую фракции путем введения коллоидного раствора хитозана в качестве активного комплексообразователя с белками молочной сыворотки. Поликатионный характер данного полисахарида открывает широкие перспективы его использования для разделения белков сыворотки молока, имеющих низкие значения изоэлектрических точек (рисунок 1) [6].

Рисунок 1 – Влияние рН на заряд хитозана и белков сыворотки молока Белки молока и молочной сыворотки в естественном состоянии (при рН выше изоэлектрической точки) имеют суммарный отрицательный заряд, обусловленный наличием карбоксильных групп, остатков фосфорной, уксусной, лимонной и других кислот.

Основными сывороточными белками являются α-лактоальбумин (α-ЛА), βлактоглобулин (β-ЛГ), бычий сывороточный альбумин (БСА), лактоферрин. Среди белков сыворотки наибольшее количество приходится на β-лактоглобулин изоэлектрическая точка которого 4,9–5,4. Поскольку β-лактоглобулин устойчив к протеолизу, то он способен вызывать аллергические реакции у детей раннего возраста, потребляющих коровье молоко. Вторым в количественном отношении белком сыворотки является α-лактоальбумин с изоэлектрической точкой 4,6. Бычий сывороточный альбумин имеет изоэлектрическую точку 4,8, благодаря особенностям строения, в сыворотке связывается со свободными жирными кислотами, липидами и многими другими гидрофобными соединениями. Лактоферрин (изоэлектрическая точка 8,0–8,8) выполняет несколько функций: обладает сильным антибиотическим действием против широкого спектра бактерий, грибов, вирусов и паразитов, противовоспалительной и противораковой активностью, а также играет существенную роль в регуляции гомеостаза ионов железа. Известно, что белки сыворотки молока: β-ЛГ, α-ЛА, иммуноглобулины, лактоферрин, проявляют свою биологическую активность непосредственно или после ферментативного гидролиза. В частичных гидролизатах сывороточных белков обнаружены пептиды с антимикробными, антиоксидантными, антифунгальными, иммуномодулирующими, гипотензивными и др. свойствами [7]. В естественном виде они присутствуют в ферментированных молочных продуктах: йогурте, кефире, брынзе и других сырах. Взаимодействие хитозана с белками молока изучено не столь полно. Однако, на основании имеющихся данных можно утверждать, что при взаимодействии двух биополимеров: «молочный белок – хитозан» наблюдается явление полной коагуляции, т.е. распада на две фазы, в одной из которых сосредоточены оба макромолекулярных реагента. Эта концентрированная фаза получила название коацерватной (в данном случае «белок + хитозан»). Вторая фаза системы – равновесная жидкость (сыворотка, содержащая лактозу, остатки сывороточных белков, минеральные вещества и др.). Макромолекулы белка и полисахарида обладают противоположными по знаку суммарными зарядами при рН ниже изоэлектрической точки белка. В этой области рН при низкой ионной силе и при определенном соотношении реагентов, образуются нерастворимые комплексы. На молекулярном уровне процесс образования электростатических комплексов можно рассматривать как последовательное присоединение макроионов белка (лигандов комплекса) к макроиону полисахарида (ядру комплекса). Белок можно считать лигандом на том основании, что в комплексе на один макроион хитозана обычно приходится большое число меньших по размеру макроионов белка. Образование комплекса «белок – хитозан» может сопровождаться как изменением баланса сил, определяющих характер внутри и межмолекулярного взаимодействия белковых глобул, так и образованием частиц комплексов, различающихся по размеру, форме, заряду, степени гидратации и т.д. Отсюда следует широкая возможность регулирования функциональных свойств белка при его комплексообразовании с природным полисахаридом хитозаном [6].

Использование хитозана для выделения белков молока

Способность хитозана образовывать комплексы с отдельными белками молока в зависимости от рН позволяет использовать это явление для выделения белков. Изучение процесса взаимодействия хитозана с белками молочной сыворотки проводили путем добавления раствора хитозана к 1% раствору деминерализованной сыворотки при рН 6,2. Хитозан, связываясь с белками, образовывал нерастворимый белковополисахаридных комплекс, при этом в течение 30 мин происходило увеличение оптической плотности при λ 580 нм. С целью отделения образовавшихся нерастворимых частиц, раствор сывороточных белков, смешанный с хитозаном, был подвергнут центрифугированию в течение 10 мин при 9000g. Проводился электрофоретический анализ белков сыворотки молока, входящих в состав нерастворимого комплекса с полисахаридом [8]. Результаты исследований показали, что основными белками, связанными с хитозаном, являются β-лактоглобулин, α-лактальбумин, БСА. Лактоферрин и некоторые минорные белки участия в образовании комплекса не принимают. Было установлено количество полисахарида, необходимого для наиболее полного извлечения основных белков из сыворотки молока. Для этого хитозан с молекулярной массой 200 кДа добавляли к раствору сывороточных белков при рН 6,2. Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальное связывание сывороточных белков с хитозаном наблюдается при содержании полисахарида в реакционной среде 0,5 мг/мл. При этом в осадок переводится более 90% белка сыворотки. При последующем увеличении содержание хитозана в растворе количество образовавшегося осадка значительно снижается [6].

Полученные данные позволяют считать перспективным для заводов, ведущих переработку молока, использование хитозана для очистки жидких производственных отходов, содержащих небольшое количество белка. Полученные белковые комплексы, содержащие хитозан, могут быть использованы для производства комбикормов. Полученные закономерности взаимодействия белков сыворотки молока с раствором хитозана создали предпосылки разработки сорбента на основе этого полисахарида. В связи с этим представлялось целесообразным разработать методы разделения белков сыворотки молока с использованием хитозан-тартратного геля (рисунок 2), для их последующего протеолиза и получения биологически активных пептидов, которые могут найти применение в функциональных продуктах питания.

Рисунок 2 – Сорбент КТГ-хитозан

Для разделения белков сыворотки молока хитозан-тартратный гель уравновешивали 0,05 М ацетатным буфером рН=6,2. Затем на колонку наносили раствор сыворотки. Промывали колонку ацетатным буфером и элюировали белок градиентом от 0,005 н до 0,1 н ЭДТА. Для определения чистоты и состава белков элюата проводили ДСН-электрофорез (рисунок 3).

1 – КСБ; 2 – элюция 0,005н ЭДТА; 3 – элюция 0,005н ЭДТА; 3 – элюция 0,01н ЭДТА; 4 – элюция 0,1н ЭДТА

Рисунок 3 – Электрофореграмма сывороточных белков молока после разделения на хитозан-тартратном сорбенте

Установлено, что использование хитозан-тартратного геля позволяет выделить β-лактоглобулин чистотой до 90%. На основе феномена специфического взаимодействия ДНК с лактоферрином молочной сыворотки был разработан оригинальный сорбент на основе кальций-тартратного геля [9] в состав которого была включена однонитевая ДНК (рисунок 4).

Рисунок 4 – Сорбент КТГ-хитозан-ДНК

Сорбент уравновешивали 0,05 Трис-HCl, рН=7,4, смешивали с молоком и помещали на 1,5 часа на шейкер. Затем центрифугировали при 2000 об/мин в течении 10 мин, промывали осадок сорбента уравновешивающим буфером, содержащим 0,01% Tween 20. После чего сорбент помещали в колонку и промывали буфером до достижения в элюате оптической плотности менее 0,1 на длине волны 280 нм. Элюцию лактоферрина с колонки проводили 0,05 М Трис-HCl буфером, содержащим 0,5 М NaCl. Лактотрансферрин, выделенный на этом аффинном сорбенте имел чистоту 96–98% [10].


Таким образом, при использовании хитозансодержащих сорбентов удается не только удалить белки из сыворотки молока, но и получить очищенные β-лактоглобулин и лактоферрин.

Использование хитозана в производстве молочных продуктов питания

Особенно востребованными в сфере питания становятся функциональные продукты, которые, обладая высокими органолептическими показателями, также оказывают и профилактический эффект. Перспективным направлением в данной области является создание функциональных блюд на основе молока и молочной сыворотки, которые являются источниками полноценного белка, комплекса витаминов и минеральных веществ. Так как хитозан является структурообразователем, эмульгатором, загустителем и осветлителем, обладает антибактериальными, противогрибковыми и антивирусными свойствами, и способен заживлять слизистую желудка, можно предположить, что его использование в кисломолочных напитках и в молочных десертах позволит создать функциональный продукт, в котором полисахарид будет выполнять роль технологического, функционального, бактерицидного или бактериостатического агента. Использование в технологии производства безалкогольных напитков хитозана, благодаря его высокой активности в процессе комплексообразования с белками молока, позволяет получить осветленную молочную сыворотку с низким содержанием белковых веществ и нейтральными органолептическими показателями (отсутствие нежелательного резкого сывороточного вкуса и запаха). Технология проста в аппаратурном оформлении и не требует значительных капитальных затрат. Способ производства газированных оздоровительных напитков с использованием хитозана осуществляется следующим образом. Из свежей молочной сыворотки удаляют остатки жира и казеинов. В подготовленную сыворотку вносят коллоидный раствор хитозана. Смесь после тщательного перемешивания выдерживают, центрифугируют. Осветленную сыворотку соединяют с заранее приготовленным купажом, затем подают на розлив в газированном виде. Наилучшие органолептические показатели имеют напитки: «Яблоко», «Персик», «Апельсин» [11]. Использование коллоидного раствора хитозана в качестве композиционного структурообразователя позволяет получить белковый комплекс для выработки продуктов нового поколения, обладающих лечебно-профилактическими свойствами. Он может быть использован для выработки обогащенного творога в качестве источника нативного белка, обладающего высокой биологической ценностью, при производстве творожных кремов в качестве сырья, а также при выработке кисломолочных напитков и сметаны. Кроме того, полученный белковый комплекс целесообразно применять в качестве белкового обогатителя при производстве молокоподобных напитков из сыворотки [12]. Для подтверждения гипотезы о применении хитозана в качестве структурообразователя были изучены свойства молочной системы (0,5% жирности) после введения хитозана (таблица 1).

Таблица 1 – Изменение свойств молочной системы после введения растворов хитозана различной концентрации

Анализ данных показывает, что увеличение количества вносимого раствора хитозана в молочную систему приводит к незначительному увеличению коэффициента эффективной вязкости у всех образцов. При содержании хитозана выше 3% наступает значительное ухудшение органолептических показателей продукта. Таким образом, в дальнейших исследованиях использовали концентрацию 3%-го раствора хитозана, которая обеспечивала относительно приемлемые органолептические показатели и не приводила к процессу комплексообразования хитозана с белками молока. Учитывая, что хитозан обладает достаточно выраженными антибактериальными и бактериостатическими свойствами была изучена взаимосвязь между его химической структурой и биологическим воздействием на клетки микроорганизмов в молочной модельной системе. В таблице 2 представлены результаты экспериментов по изучению влияния высокомолекулярного хитозана (степень дезацетилирования – 92%, ММ – 350 кДа) на рост тест-культур E.coli DSM 396 в молочной модельной системе.

Таблица 2 – Динамика развития E.coli DSM 396 в молочных модельных системах

Анализ данных показал, что в течение трех суток количество клеток E.coli в образцах с добавлением хитозана снизилось с 106 до 104 КОЕ/г, в то время как в контрольном образце, приготовленном с добавлением E.coli, но без использования хитозана – число клеток, напротив, возросло до 107 КОЕ/г т.о. хитозан (степень дезацетилирования – 92%, ММ – 350 кДа) в концентрации 3% (3%-го раствора), добавленный в молочную модельную систему, демонстрирует бактерицидное действие в отношении грамотрицательного микроорганизма E.Coli DSM 396. Также проводились исследования в отношении плесневых грибов, полученные данные свидетельствуют о выраженном фунгистатическом действии хитозана и дают возможность его использования в качестве природного консерванта в технологии неферментированных молочных десертов. Молочные десерты готовились следующим образом: молоко (0,5% жирности) нормализовали по жирности сливками (3,5% жирности – напиток, 5% жирности – пудинг), вносили альгинат натрия (0,3% напиток, 0,5% пудинг), оставляли для набухания на 30–40 мин, затем нагревали до температуры 50–60°С, добавляли 3%-ный раствор хитозана в количестве 3%, подсластитель – фруктозу и перемешивали смесь в течение 3 минут при 650 об/мин. Затем смесь пастеризовали (80°С, 5 минут), добавляли вкусовые наполнители, перемешивали и охлаждали смесь [13]. Также было установлено, что разработанные молочные десерты оказывают протекторное действие в отношении эрозивно-язвенных поражений, вызываемых с помощью аспириновой модели повреждения желудка, что позволяет отнести продукт к группе функциональных продуктов [14]. Таким образом, использование хитозана в молочной промышленности на данном этапе представляется весьма перспективным, так как позволяет выгодно перерабатывать молочное белково-углеводное сырье, исключив при этом значительные энергозатраты. Вместе с тем полученные при это продукты будут обладать лечебно-профилактическими свойствами, что сделает их привлекательными для потребителя и, как следствие, конкурентоспособными на рынке продуктов питания.

Список литературы

1. Цыган, В.Н. Хитозан как парафармацевтик / В.Н. Цыган, К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин //Рынок БАД – СПб. – 2002. – №2(4). – С. 1–7.

2. Нечаев, А.П. Пищевые добавки / А.П. Нечаев, А.А. Кочеткова, А.Н. Зайцев. – Москва: Колос, Колос-Пресс, 2002. – 256 с.

3. Тарасенко, Г.А. Экспериментальное обоснование гипохолестеринемического действия хитозана из панциря камчатского краба// Материалы 5-ой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: изд. ВНИРО, 25–27 мая – 1999. – С. 198

4. Тесленко, А.Я. Использование хитинсодержащих сорбентов для решения экологических задач/ А.Я. Тесленко, И.Н. Воеводина, С.В. Николаева // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. – М.: ВНИРО, 1992. – С. 99–104.

5. Варламов, В.П. Хитин и хитозан: природа, получение и применение/ В.П. Варламов, С.В. Немцев, В.Е. Тихонов. – Щелково: Изд-во Российского Хитинового Общества, 2010. – 292 с.

6. Курченко, В.П. Механизм взаимодействия хитозана с белками молочной сыворотки / В.П. Курченко, Л.Р. Алиева, Т.В. Буткевич, Н.В. Гавриленко // Труды БГУ. Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. – 2013. – Т.8, ч.1. – С. 45–51.

7. Головач, Т.Н. Аллергенность белков молока и пути ее снижения/ Т.Н. Головач, В.П. Курченко // Труды БГУ. – 2010. – Т. 5,Ч. 1. С.9–55.

8. Выделение β-лактоглобулина из сыворотки: использование различных форм хитозана / В.П.Варламов [и др.] // Молочная промышленость. – 2013. – № 10. – С. 11–12.

9. Способ получения сорбента для выделения ДНК: Патент №14225 [Электронный ресурс] / А.П. Дрожденюк; Дата публикации 30.04.2011 // belgospatent. – 2007. Mode of access: http://www.belgospatent.org.by.

10. Курченко, В.П. Выделение лактоферрина из женского, козьего и коровьего молока различными методами аффинной хроматографии/ В.П. Курченко, М.А. Капустин, Н.В. Гавриленко, А.П. Дрожденюк // Труды БГУ, – 2011. – Т 6, Ч.1. – С. 86–96.

11. Василисин, С.В. Газированные оздорови тельные напитки с использованием хитозана / С. В. Василисин, И.Л. Евдокимов, Л.Р. Алиева, M.С. Попова (М.С. Золоторева), Д.Н. Володин // «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» материалы Шестой Междунар. конф. – M.: Издательство ВНИРО. – 2001. С. 149–150.

12. Евдокимов, И.А. Основные направления применения хитозана в технологиях молочных продуктов/ И.А. Евдокимов, С.В. Василисин, Л.Р. Алиева // Переработка молока. – 2005. – №2.

13. Бучахчян, Ж.В. Технология молочных неферментированных десертов, обогащенных альгинатом натрия и хитозаном / Ж.В. Бучахчян, Л.Р. Алиева, И.А. Евдокимов и др. // Научный журнал КубГАУ [Электронный ресурс]. – Краснодар: КубГАУ, 2012. – №75(01).

14. Evdokimov, I.A. Functional food with chitosan in erosion damage of the gastric mucosa in rats/ I.A. Evdokimov, R.O. Budkevich, J.V. Buchakhchyan, L.R.Alieva, E.V. Budkevich //2 -nd International ISEKI Food Conference. – Milan, 2011.– 200 p.